關(guān)于進(jìn)境鴕鳥檢疫有關(guān)問題的通知 （動(dòng)植檢動(dòng)字〔1996〕87號(hào)）

關(guān)于進(jìn)境鴕鳥檢疫有關(guān)問題的通知

（動(dòng)植檢動(dòng)字〔1996〕87號(hào)）

各直屬口岸動(dòng)植物檢疫局、動(dòng)物檢疫所：

近年來，鴕鳥的引進(jìn)和繁養(yǎng)在我國(guó)呈現(xiàn)了迅猛發(fā)展的勢(shì)頭，為滿足引進(jìn)鴕鳥及其種蛋的需要，一年多來，我們先后與美國(guó)、加拿大、法國(guó)、荷蘭、津巴布韋、博茨瓦那、澳大利亞和納米比亞簽署了進(jìn)境鴕鳥的檢疫和衛(wèi)生條件議定書，從而為引進(jìn)鴕鳥在檢疫方面鋪平了道路。隨著鴕鳥的大量引進(jìn)，我們的檢疫工作也日趨繁重，而鴕鳥的檢疫在我國(guó)還是個(gè)嶄新的課題，為總結(jié)近年來進(jìn)境鴕鳥的檢疫經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步提高檢疫水平，防止疫病隨進(jìn)口鴕鳥及其種蛋傳入我國(guó)，使鴕鳥的檢疫工作更加規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，保證進(jìn)境鴕鳥檢疫工作的順利進(jìn)行，現(xiàn)就進(jìn)境鴕鳥及其種蛋入境后的檢疫工作的有關(guān)問題通知如下：

一、進(jìn)境鴕鳥檢疫

1.鴕鳥入境后須在口岸動(dòng)植物檢疫局指定的隔離場(chǎng)所進(jìn)行為期45天的隔離檢疫，如須延長(zhǎng)隔離檢疫時(shí)間，須報(bào)國(guó)家局批準(zhǔn)。

2.鴕鳥運(yùn)抵隔離場(chǎng)一周后，逐只進(jìn)行采血采樣，并分成兩份，其中一份保存?zhèn)洳?，并注意編?hào)。

3.隔離檢疫期間的實(shí)驗(yàn)室檢疫項(xiàng)目，主要依照我國(guó)與輸出國(guó)締結(jié)的鴕鳥檢疫議定書規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室檢疫項(xiàng)目進(jìn)行。如發(fā)生特種情況可做特殊檢疫項(xiàng)目。

4.實(shí)驗(yàn)室檢疫的操作試行程序附后。

二、進(jìn)境鴕鳥種蛋檢疫

1.進(jìn)境種蛋的孵化廠須獲得口岸動(dòng)植物檢疫機(jī)關(guān)的認(rèn)可。

2.進(jìn)境鴕鳥種蛋在入孵前，須用有效的消毒藥進(jìn)行熏蒸處理。

3.進(jìn)境種蛋不得與其他種蛋一同孵化。

4.首次孵出的小鳥須在口岸動(dòng)植物檢疫機(jī)關(guān)認(rèn)可的場(chǎng)所由口岸檢疫機(jī)關(guān)隔離檢疫30天，在此期間采樣并依照我國(guó)與輸出國(guó)締結(jié)的鴕鳥種蛋的檢疫議定書規(guī)定的項(xiàng)目作實(shí)驗(yàn)室檢疫。

三、其他未盡事宜按《進(jìn)境動(dòng)物檢疫管理辦法》執(zhí)行。

四、在執(zhí)行過程中有何問題，請(qǐng)及時(shí)上報(bào)國(guó)家局。

附件：鴕鳥疫病實(shí)驗(yàn)室檢疫操作試行規(guī)程

中華人民共和國(guó)動(dòng)植物檢疫局

一九九六年八月二十六日

鴕鳥沙門氏菌泄殖腔拭子培養(yǎng)規(guī)程（試行）

一、材料：

滅菌棉拭子、緩沖蛋白胨水、亞硒鹽胱氨酸增菌液、膽硫乳瓊脂、三糖鐵瓊脂、生化試驗(yàn)管、多價(jià)血清因子、細(xì)菌培養(yǎng)必需設(shè)備。

二、操作方法：用無菌棉拭子從泄殖腔取樣，放無菌瓶中，盡可能冷藏于2～4℃，編號(hào)后送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

三、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)：

鴕鳥鸚鵡熱間接血凝（IHA）操作規(guī)程（試行）

一、本規(guī)程適用于鴕鳥衣原體病的診斷。

二、材料

衣原體屬抗原致敏綿羊紅細(xì)胞

標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性對(duì)照血清

被檢血清：采集鴕鳥血清，試驗(yàn)前于56℃水浴滅活30分鐘。

90度V型反應(yīng)板

滅菌生理鹽水

微量加樣器

三、試驗(yàn)方法

1.將生理鹽水滴于V型反應(yīng)板中，每孔50ul。

2.取被檢血清50ul于第一孔中，與生理鹽水混勻后吸50ul于第二孔，依次作倍比稀釋至1:16。

3.將1:8和1:16兩孔各加25ul抗原，如作定量試驗(yàn)可根據(jù)實(shí)際需要自行決定。

4.對(duì)照試驗(yàn)：設(shè)陽性血清＋抗原、陰性血清＋抗原、生理鹽水＋抗原各一孔。

四、血凝反應(yīng)程度的標(biāo)準(zhǔn)：

“＋＋＋＋”：紅細(xì)胞全部凝集，形成一層均勻的膜，布滿整個(gè)孔底。

“＋＋＋”：紅細(xì)胞在孔底形成一層薄膜，面積比前者稍小。

“＋＋”：紅細(xì)胞在孔底形成薄層凝集，邊緣松散或呈鋸齒狀。

“＋”：紅細(xì)胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圓點(diǎn)。

“＋”：紅細(xì)胞沉于孔底，但周圍不光滑或中心有空斑。

“―”：紅細(xì)胞完全沉于孔底，呈光滑的圓點(diǎn)。

“＋＋”以上的凝集判為陽性凝集。

五、結(jié)果判定

1.對(duì)照試驗(yàn)：出現(xiàn)如下結(jié)果試驗(yàn)方可成立，否則應(yīng)重試，陽性血清＋抗原呈“＋＋＋＋”；陰性血清十抗原呈“-”；抗原十生理鹽水。

2.被檢樣品判定標(biāo)準(zhǔn)：血清效價(jià)＞1:8（＋＋）判為陽性。

鴕鳥新城疫、禽流感、付粘病毒分離操作規(guī)程（試行）

本規(guī)程適用于新城疫、禽流感、付粘病毒的分離

一、材料

1.消毒棉拭子

2.滅菌試管

3.滅菌生理鹽水

4.泄殖腔棉拭子保存液：PBS，PH7.2-7.4，青霉素1萬單位/ml，鏈霉素10mg/m1，慶大霉素250ug/ml，制霉素5000u/ml。

5.SPF種蛋。

6.90度V型反應(yīng)板。

7.微量加樣器。

二、操作方法

1.將采集的泄殖腔棉拭子置于樣品保存液中，置4℃過夜。次日3000rpm離心10min，上清液作菌檢后接種9～10日齡雞胚（每胚0.2ml），37℃再孵育5天，去掉24小時(shí)死亡的雞胚，其他雞胚放4℃冷卻后，檢測(cè)雞胚尿囊液的血凝滴度。如尿囊液的血凝反應(yīng)呈陰性，應(yīng)再用雞胚盲傳2代。

2.將收集的尿囊液用PBS以25ul量進(jìn)行倍比稀釋，加25ul的1%雞紅細(xì)胞，輕輕混勻，靜置15～30min，判定血凝滴度。

如雞胚尿囊液的血凝試驗(yàn)呈陽性，應(yīng)分別用新城疫病毒、禽流感病毒、副粘病毒的陽性血清作血凝抑制試驗(yàn)以檢測(cè)病毒的種類。

表一　雞胚尿囊液血凝試驗(yàn) （單位：ul）（略）

禽流感血凝抑制試驗(yàn)操作程序（試行）

一、試驗(yàn)材料

1.抗原：禽流感病素H5、H7型抗原；

2.陰、陽性對(duì)照血清。

3.紅細(xì)胞：無菌采集雞血液5～10ml于少許阿氏液中搖勻，以洗滌3～5次，每次3000rpm離心10min，將血漿、白細(xì)胞充分洗去至上清液清亮，再將沉淀的紅細(xì)胞稀釋成1%的紅細(xì)胞懸浮液（RBC）；

4.被檢血清：采集被檢鴕鳥血液，離心分離血清，56℃滅活30min；

5.稀釋液：滅菌的生理鹽水或PBS（pH7.2～7.4）

6.90度V型反應(yīng)板，微量加樣器。

二、試驗(yàn)操作

1.血凝試驗(yàn)（HA）：

取干凈的微量滴定板（V型）一塊，按表一進(jìn)行操作：每孔加25ul生理鹽水，孔1加禽流感抗原25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3；如此依次稀釋到孔10，孔10混勻后吸出25ul棄掉?？?1、12不加抗原，只加生理鹽水作空白對(duì)照。加入1%的紅細(xì)胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫；每5min觀察一次，15～30min后判定結(jié)果，并作好記錄。

表一　禽流感血凝試驗(yàn)（單位：ul）（略）

抗原的血凝滴度是凡能使1%的雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)；因此，能使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋倍數(shù)的病毒液25ul稱為1個(gè)血凝單位（HA）。如該抗原的血凝單位為1:128/25ul。

在進(jìn)行禽流感血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，病毒的工作濃度應(yīng)為8HA。因?yàn)樵撛囼?yàn)的抗原的血凝單位為1:128/25ul，按其孔號(hào)數(shù)（孔.7）倒退3孔的稀釋倍數(shù)（孔4　1:16），作為該病毒的工作濃度：1:16/25ul。

2.血凝抑制試驗(yàn)（HI）：

取干凈的微量滴定板（V型）一塊，按表二進(jìn)行操作：每孔加25ul生理鹽水，孔1加待檢血清25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3；如此依次稀釋到孔8，孔8混勻后吸出25ul棄掉?？?作為陽性血清對(duì)照，孔10作為陰性血清對(duì)照，孔11不加任何血清而作為抗原對(duì)照，孔12不加抗原和任何血清，只加PBS作空白對(duì)照。各孔加入1%的紅細(xì)胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫；每5min觀察一次，15～30min后判定結(jié)果，并作好記錄。

未免疫的健康鴕鳥血清無血凝抑制作用，各稀釋倍數(shù)均出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象；禽流感感染或免疫的鴕鳥血清能抑制禽流感病毒對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用。凡能使8HA的抗原凝集紅細(xì)胞作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的血凝抑制價(jià)（如表二的血凝抑制價(jià)為1:64）。

表二　禽流感血凝抑制試驗(yàn)（單位：ul）（略）

3.判定標(biāo)準(zhǔn)

1）判定時(shí)應(yīng)首先觀察各對(duì)照孔是否完全符合；

2）紅細(xì)胞凝集：紅細(xì)胞分散在孔底四周呈均勻的顆粒狀凝集且布滿整個(gè)孔底，判為血凝作用為陽性“十”；

3）無凝集或凝集抑制：紅細(xì)胞集中于孔底中央呈點(diǎn)狀，判血凝作用為陰性“―”，或判血凝抑制作用為陽性；

4）血凝抑制價(jià)：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀釋倍數(shù)；

5）被檢血清的血凝抑制價(jià)在1:8以上者，判為陽性反應(yīng)；

6）最后判定時(shí)間與感作時(shí)間有關(guān)。溫度高時(shí)感作時(shí)間短，15min即可；溫度低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)，但最長(zhǎng)不得超過30min。

禽流感瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)操作規(guī)程（試行）

1.瓊脂凝膠平板的制備：稱取瓊脂糖1g，氯化鈉8.5g，加入100ml蒸餾水，10磅10分鐘高壓溶解后，冷卻至45℃，加入0.01%疊氮鈉，每個(gè)直徑6CM平皿加7ml融化瓊脂，厚度為2.8mm，待凝固后置冰箱內(nèi)片刻。

2.打孔：中間一孔，周圍六孔為一組，孔徑3mm，孔居2.5mm。

3.加樣：中心孔加抗原，周圍1、3、5孔加陽性血清，2、4、6孔加被檢血清。

4.加樣后置濕盒內(nèi)，于室溫下感作。

5.結(jié)果判定：24小時(shí)初判，48小時(shí)終判，陽性對(duì)照成立時(shí)，進(jìn)行判定。

陽性：被檢血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)致密沉淀線，并與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的沉淀線末端互相聯(lián)接。

可疑：標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔和抗原孔之間的沉淀線向被檢血清孔內(nèi)側(cè)彎曲。

陰性：抗原孔與被檢血清孔之間不出現(xiàn)沉淀線或標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與陽性孔間的沉淀線向毗鄰的被檢血清孔直伸或其外側(cè)偏彎。

禽副粘病毒血凝抑制試驗(yàn)操作程序

一、試驗(yàn)材料

1.抗原：禽副粘病毒病毒Ⅱ型抗原；

2.紅細(xì)胞：無菌采集雞血液5～10ml于少許阿氏液中搖勻，以洗滌3～5次，每次3000離心10min，將血漿、白細(xì)胞充分洗去至上清液清亮，再將沉淀的紅細(xì)胞稀釋成1%的紅細(xì)胞懸浮液（RBC）；

3.被檢血清：采集被檢鴕鳥血液，離心分離血清，56℃滅活30min；

4.稀釋液：滅菌的生理鹽水或PBS（pH7.2～7.4）

5.陰、陽性對(duì)照血清

6.90度V型反應(yīng)板，微量加樣器。

二、試驗(yàn)操作

1.血凝試驗(yàn)（HA）：

取干凈的微量滴定板（V型）一塊，按表一進(jìn)行操作：每孔加25ul生理鹽水，孔1加禽流感抗原25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3；如此依次稀釋到孔10，孔10混勻后吸出25ul棄掉?？?1、12不加抗原，只加生理鹽水作空白對(duì)照。加入1%的紅細(xì)胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫；每5min觀察一次，15～30min后判定結(jié)果，并作好記錄。

表一　禽副粘病毒血凝試驗(yàn)（單位：ul）（略）

抗原的血凝滴度是凡能使1%的雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)；因此，能使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋倍數(shù)的病毒液25ul稱為1個(gè)血凝單位（HA）。如該抗原的血凝單位為1:128/25ul。

在進(jìn)行禽副粘病毒血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，病毒的工作濃度應(yīng)為4HA。因?yàn)樵撛囼?yàn)的抗原的血凝單位為1:128/25ul，按其孔號(hào)數(shù)（孔7）倒退2孔的稀釋倍數(shù)（孔5，1:16），作為該病毒的工作濃度：1:32/25u1。

2.血凝抑制試驗(yàn)（HI）：

取干凈的微量滴定板（V型）一塊，按表二進(jìn)行操作：每孔加25ul生理鹽水，孔1加待檢血清25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3；如此依次稀釋到孔8，孔8混勻后吸出25ul棄掉?？?作為陽性血清對(duì)照，孔10作為陰性血清對(duì)照，孔11不加任何血清而作為抗原對(duì)照，孔12不加抗原和任何血清，只加生理鹽水作空白對(duì)照。各孔加入1%的紅細(xì)胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫；每5min觀察一次，15～30min后判定結(jié)果，并作好記錄。

表二　禽副粘病毒血凝抑制試驗(yàn)（單位：ul）（略）

未免疫的健康鴕鳥血清無血凝抑制作用，各稀釋倍數(shù)均出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象；禽副粘病毒感染或免疫的鴕鳥血清能抑制禽副粘病毒對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用。凡能使8HA的抗原凝集紅細(xì)胞作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的血凝抑制價(jià)（如表二的血凝抑制價(jià)為1:64）。

3.判定標(biāo)準(zhǔn)

1）判定時(shí)應(yīng)首先觀察各對(duì)照孔是否完全符合；

2）紅細(xì)胞凝集：紅細(xì)胞分散在孔底四周呈均勻的顆粒狀凝集且布滿整個(gè)孔底，判為血凝作用為陽性“十”；

3）無凝集或凝集抑制：紅細(xì)胞集中于孔底中央呈點(diǎn)狀，判血凝作用為陰性“-”，或判血凝抑制作用為陽性；

4）血凝抑制價(jià)：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀釋倍數(shù)；

5）被檢血清的血凝抑制價(jià)在1:8以上者，判為陽性反應(yīng)；

6）最后判定時(shí)間與感作時(shí)間有關(guān)。溫度高時(shí)感作時(shí)間短，15min即可；溫度低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)，但最長(zhǎng)不得超過30min。

鴕鳥新城疫血凝抑制試驗(yàn)操作規(guī)程（試行）

一、試驗(yàn)材料

1.抗原：選擇對(duì)紅細(xì)胞凝集作用強(qiáng)的雞新城疫弱毒株接種雞胚，收獲尿囊液和羊水制備。

2.紅細(xì)胞：采健康雞血液5～10ml，于少許阿氏液中搖勻，以生理鹽水洗3～5次，每次3000rpm離心5～10分鐘，將血漿、白細(xì)胞充分洗去至上清液清亮，再將沉淀的紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋成1%的紅細(xì)胞懸浮液。

3.被檢血清：采集被檢鴕鳥血液分離血清，試驗(yàn)前56℃滅活30分鐘。

4.生理鹽水：滅菌的生理鹽水或PBS（pH6.5～7.2）。

5.90度V型反應(yīng)板，微量加樣器。

二、試驗(yàn)操作

1.血凝試驗(yàn)（HA）：

取干凈的微量血凝反應(yīng)板（V型）一塊，按表一進(jìn)行操作，每孔加生理鹽水25ul，孔1加鴕鳥新城疫抗原25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；再吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3，依次稀釋到孔10，孔10混勻后吸出25ul棄掉?？?1、12不加生理鹽水作空白對(duì)照。然后加入1%的紅細(xì)胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫，每5分鐘觀察一次，15分鐘后判定結(jié)果并作好記錄。

抗原的血凝價(jià)為凡能使紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)，即該病毒的血凝滴度。如表一血凝價(jià)為1:128，因此能使雞紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋倍數(shù)和病毒液25ul為該病毒的1個(gè)血凝單位（HA），在進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，病毒工作濃度為4HA。如該試驗(yàn)的病毒血凝價(jià)為1:128，按其孔號(hào)數(shù)（孔7）倒退兩孔的稀釋倍數(shù)（孔5），即該病毒液作1:32稀釋。

2.血凝抑制試驗(yàn)（HI）：

取干凈的微量血凝滴定板（V型）一塊，按表二進(jìn)行操作，每孔加生理鹽水25ul，孔1加被檢血清25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次，再吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3，依次稀釋到孔8，孔8混勻后吸出25ul棄掉，孔9作為陽性血清對(duì)照，孔10作為陰性血清對(duì)照，孔11不加血清作為抗原對(duì)照，孔12不加生理鹽水作空白對(duì)照。然后各孔加入含4HA的抗原25ul，充分振蕩后室溫靜置感作5～6分鐘；再加入1%的紅細(xì)胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫，每5分鐘觀察一次，15分鐘后判定結(jié)果，并作好記錄。

健康鴕鳥血清無抑制作用，各稀釋倍數(shù)均無紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象；感染鴕鳥或免疫鴕鳥血清能抑制對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用，凡能使4HA的抗原凝集紅細(xì)胞作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的血凝抑制價(jià)（如表二的血凝抑制價(jià)為1:64）。

3.判定標(biāo)準(zhǔn)

1）判定時(shí)應(yīng)首先觀察各對(duì)照孔是否完全符合。

2）紅細(xì)胞凝集：紅細(xì)胞分散在孔底四周呈均勻的顆粒狀凝集且布滿整個(gè)孔底，判血凝作用為陽性（十）。

表一　新城疫血凝試驗(yàn)（單位：ul）（略）

表二　新城疫血凝抑制試驗(yàn)（單位：ul）（略）

3）無凝集或凝集抑制：紅細(xì)胞集中于孔底中央呈點(diǎn)狀，判血凝作用為陰性（一），或判血凝抑制作用為陽性。

4）血凝抑制價(jià)：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制最高血清稀釋倍數(shù)。

5）被檢血清的血凝抑制價(jià)在1：32以上者，判定為陽性反應(yīng)。

6）最后判定時(shí)間與感作溫度有關(guān)，溫度高時(shí)需要時(shí)間短，15分鐘即可，溫度低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)，但最長(zhǎng)不得超過30分鐘。